Prvi dokaz rikecije Anaplasma ovis u oboljelog ovna: od kliničkih znakova bolesti do genske tipizacije uzročnika
T. Šarić, A. Beck, I. Taraš, A. Šuto, D. Orlović, D. Juković i R. Beck*
Sažetak
Krajem svibnja 2015. godine u Laboratorij za parazitologiju, Hrvatskog veterinarskog instituta, Zagreb, Hrvatska dostavljena je krv ovna iz okolice Benkovca sa sumnjom na piroplazmozu. Ovan je uz potpornu terapiju vitaminima AD3E i B-kompleksa liječen imidokarbom (Imizol® 0,5 mL s/c) i oksitetraciklinom (Geomicin® retard 5 mL i/m) te je za pet dana prestao pokazivati kliničke znakove bolesti. U razmazu krvi pronađena su periferno smještena intraeritrocitarna tjelešca, a sekvenciranjem odsječka 16S rRNK i MSP4 gena dokazali smo vrstu Anaplasma ovis, dok DNK drugih uzročnika nije bila prisutna.
Ovim istraživanjem smo po prvi puta dokazali vrstu A. ovis u Hrvatskoj, ali i u Jugoistočnoj Europi. Od danas priznatih osam vrsta anaplazmi, anaplazmozu malih preživača uzrokuju tri vrste A. phagocytophilum, A. capra i A. ovis od kojih je A. phagocytophilum dokazana u Hrvatskoj. Prema navodima veterinara Veterinarske ambulante Benkovac opisani klinički znaci bolesti su česti u ovaca i ovnova dopremljenih s drugih područja Hrvatska i nikada nisu uočeni u životinja mlađih od pet mjeseci. Treba naglasiti da osim Imizolom® veterinari na području Benkovca oboljele ovce uvijek liječe i tetraciklinima što predstavlja i lijek izbora, a oboljele životinje uspješno izliječe ukoliko lijekove apliciraju unutar pet dana od pojave kliničkih znakova bolesti.
Vektor je krpelj Rhipicephalus bursa prisutan diljem Republike Hrvatske ujedno pronađen i na oboljelom ovnu. Stoga treba očekivati da je uzročnik prisutan i u drugim dijelovima Hrvatske.Ključne riječi: Anaplasma ovis, ovan, klinička slika, terapija, objektivna dijagnostika, Benkovac
Uvod
Anaplazmoze su krpeljima prenosive neutropenije/pancitopenije, hemolitičke anemije i trombocitopenije popraćene općim infekcioznim sindromom.
U pravilu ih uzrokuju obligatno intracelularne alfa proteobakterije iz roda Anaplasma (porodica Anaplasmataceae, red Rickettsiales). Do danas je unutar roda Anaplasma opisano osam vrsta; A. phagocytophilum, A. marginale, A. centrale, A. ovis, A. bovis, A. platys, A. odocoilei i A. capra (Rar i sur., 2021.). Molekularnim istraživanjima dokazani su i drugi genotipovi koji se temeljem analize sekvenci ne podudaraju niti s jednom od osam potvrđenih vrsta te stoga nisu grupirani u nove vrste ili podvrste (Rar i sur., 2021.).
Uzročnici anaplazmoze malih preživača su A. phagocytophilum, A. capra i A. ovis. Važno je istaknuti da A. ovis osim eritrocita ovaca, koza (Friedhoff, 1997., Yasini i sur., 2012., Cabezas-Cruz i sur., 2019.) i divljih preživača (Tibbitts i sur., 1992., de la Fuente, 2007., Pereira i sur., 2016., Wang i sur., 2019.), može inficirati i eritrocite kamelida (Selmi i sur., 2020.) i goveda (Alanaz i sur., 2021.). Potonja rikecija ima i zoonotski potencijal kojeg su Chochlakis i sur. (2010.) opisali u jedanaestogodišnjeg pacijenta s Cipra u kojeg je A. ovis prouzročila uz naglašeno povišenje serumskih transaminaza i hipertermiju, anemiju, trombocitopeniju.
Infekcije preživača rikecijom A. ovis učestale su u Aziji, Africi i Sjevernoj Americi, primarno u za tu bolest endemskim tropskim i suptropskim područjima (Renneker i sur., 2013.).
Donedavno se je anaplazmoza preživača na Europskom kontinentu smatrala isključivo na području Sredozemlja endemskom bolešću (de la Fuente i sur., 2005., Torina i sur., 2008.a, Torina i sur., 2008.b, Renneker i sur., 2013., Cabezas-Cruz i sur., 2019., Lacasta i sur., 2020.).
Početkom novog tisućljeća dokazana je i u državama Srednje Europe; prvo u Mađarskoj (Hornok i sur., 2007.), a zatim i u Slovačkoj (Derdakova i sur., 2011.).
Odrasle jedinke ovaca koje su uzgojene i obitavaju u endemskim područjima najčešće ne pokazuju vidljive kliničke znakove infekcije s rikecijom A. ovis te predstavljaju rezervoare uzročnika.
Tada je rikecijemija u krvi ovaca niska i teško se može dokazati slabije osjetljivim testovima (Shabana i sur., 2018.).
Ukoliko su inficirane životinje izložene povećanom stresu, bilo koje vrste, dolazi do pojave nespecifičnih simptomima poput inapetencije koju zatim slijede neznatni pad mliječnosti i/ili apatičnost (Stuen i sur., 2016.).
Fizičko iscrpljivanje ovaca inficiranih s A. ovis često kulminira nakon janjenja.
Ako se ovca istovremeno inficira nekim drugim mikroorganizmom/mikroorganizmima, tada dolazi do razvoja kliničkih znakova bolesti, a posljedica su nagla i obimna destrukcije eritrocita (Yasini i sur., 2012., Jimenez i sur., 2019.). Anemiju prate izražena hipertermija, tahikardija i tahipneja. U početnoj fazi razvoja bolesti javlja se izrazita bljedoća sluznica koja postupno prelazi u žuticu, što je posljedica eksponencijalnog umnažanja rikecija u eritrocitima te ekstravaskularne hemolize, odnosno fagocitoze i uklanjanja zaraženih eritrocita iz cirkulacije slezenskim makrofagima (Yasini i sur., 2012., Jimenez i sur., 2019., Lacasta i sur., 2020.). U kasnijoj se fazi može razviti anoreksija s posljedičnim gubitkom težine i kroničnom anemijom (Jimenez i sur., 2019.). Anaplazmoza u ovaca se smatrala bolešću odraslih jedinki sve dok Lacasta i sur. (2020.) molekularnim testovima nisu potvrdili da A. ovis uzrokuju znatne gubitke u proizvodnji janjećeg mesa u pokrajini Aragon u Španjolskoj. U slezenama, naizgled zdrave janjadi, A. ovis je dokazana u 72,72 % jedinki na liniji klanja. Istraživanjem je obuhvaćeno 492 janjaca podrijetlom s dvije farme, od čega je 34,84 % od 492 trupova zbog izraženog ikterusa moralo biti odbačeno.
S obzirom da anaplazmoza ovaca spada u skupinu vektorima prenosivih bolesti važno je navesti i krpelje koji omogućavaju njezino održavanje i širenje. Krpelji iz rodova Rhipicephalus i Dermacentor smatraju se vektorima A. ovis (Rymaszewska i Grenda, 2008.), a DNK A. ovis je dokazana u vrsta Rhipicephalus turanicus i R. sanguineus prikupljenih s preživača te u krpelja Dermacentor nuttalli, D. abaensis i Haemaphysalis quinghaiensis prikupljenih iz okoliša (Aktas i sur., 2009., Belkahia i sur., 2019., Enkhtaivan i sur., 2019., Han i sur., 2019.). Do sada je pokusno dokazan prijenos muškim krpeljima vrste Dermacentor andersonii (Kocan i Stiler, 1992.). Mehanizam prenošenja anaplazmoze unutar stada temelji se na pretpostavci da se jedan krpelj hrani na više ovaca i pritom se ubodom s jedinke na jedinku prenosi A. ovis (Yin i Luo, 2007.). Slično objašnjenje su ponudili Derdakova i sur. (2011.) kada su u ovaca iz enzootskog područja južne Slovačke dokazali DNK A. ovis u 60 % uzoraka krvi, ali ne u krpelja koji su se hranili na ovcama (Derdakova i sur., 2011.). Zhao i sur. (2018.) istražili su vektorski potencijal krpuše (Melaphogus ovinus) učestalog i globalno rasprostranjenog trajnog hematofagnog ektoparazita ovaca. Temeljem nalaza DNK anaplazmi u kukuljicama zaključili su da krpuše transovarijski (vertikalno) prenose A. ovis. Jimenz i sur. (2019.) su svojim istraživanjem odbacili mogućnost vertikalnog prijenosa s inficirane ovce na janjad.
Dijagnostika anaplazmoze ovaca može biti mikroskopska, serološka i molekularna. Najmanje osjetljiv, ali ujedno i najdostupniji i najjednostavniji test predstavlja mikroskopska pretraga krvnih razmaza bojanih po Giemsi.
Mikroskopskom pretragom moguće je utvrditi razvojne stadije na površini eritrocita. Anaplasma ovis nalazi se na rubu inficiranog eritrocita kao okrugla, homogeno obojene plavo-ljubičaste inkluzije promjera 0,2-0,5 μm pa se hematološka, mikroskopska potvrda A. ovis temelji na nalazu takozvanih „marginalnih inkluzija“ (Shabana i sur., 2018.).
Ovčja se anaplazmoza može dijagnosticirati i dokazom protutijela imunoflourescencijom (IFA) ili kompetitivnim imunoenzimskim testom (cELISA). Osjetljivost im je veća od mikroskopskog pregleda, osobito u slučajevima kroničnih infekcija (Shabana i sur., 2018.).
Najosjetljiviji test s visokom specifičnosti je lančana reakcija polimerazom (PCR) koji se provodi iz uzorka pune krvi. PCR test prepoznaje akutne infekcije nedetektabilne cELISA-om, kao i one kronične s malim brojem inficiranih eritrocita u perifernoj krvi (Torina i sur., 2012.).
U dosadašnjim istraživanjima anaplazmoze životinja u Republici Hrvatskoj vrste A. phagocytophulum i A. platys dokazane su lančanom reakcijom polimerazom i sekvenciranjem kod 2,5 %, odnosno 0,3 %, naizgled zdravih pasa (Huber i sur., 2017.). A. phagocytophilum je molekularno dokazana i u uginulih pasa s drugim komorbiditetima (Beck i sur., 2019.). U krvi 6,21 % i 4,5 % pasa utvrđena su protutijela na anaplazme (Mrljak i sur., 2017., Jurković i sur., 2019.).
A. phagocytophilum je lančanom reakcijom polimerazom i sekvenciranjem dokazana u malih šumskih glodavaca, divljih preživača (srna, jelen obični, jelen lopatar, divokoza, muflon), A. bovis u slezeni srne, jelena, muflona i lisica, dok genotip A. centrale identičan izolatu uobičajenom za divlje papkare iz Japana dokazan u 1,7 % slezena divokoza i muflona u priobalju (Beck i sur., 2014.). Jurković i sur. (2020.) opisali su prve nalaze A. bovis u uginulih goveda s anemijom iz okolice Fužina, a DNK A. marginale izdvojena je iz krvi anemičnih i uginulih goveda s područja Gline.
Uzgoj ovaca u priobalju Republike Hrvatske ima višestoljetnu tradiciju (Šupe i Radinović, 1993.). Veterinari Veterinarske ambulante Benkovac (44°02’07.9”N, 15°37’00.5”E) obavljaju veterinarsku djelatnost na području Grada Benkovca te općina Lišane Ostrovičke, Polača i Stankovci. Na ovom tradicionalno ovčarski orijentiranom terenu, ukupne površine oko 660 km2 i danas se uzgaja od 30 000 do 35 000 grla ovaca (Šupe i Radinović, 1993., Garibović i sur., 2006., osobno priopćenje).
Neposredno nakon Domovinskog rata uočeni su prvi sporadični slučajevi „ovčje piroplazmoze“ koja „nije reagirala“ na liječenje Imizolom® i kod koje je s vremenom uočena izrazita sezonska pojavnost. Posljednjih 20-tak godina uočen je stalni porast slučajeva sezonske febrilne anemije krpeljima invadiranih ovaca u benkovačkom kraju koje su unatoč poduzetom liječenju nerijetko završavale letalnim ishodom. U proljeće 2005. godine je u terapijski protokol po prvi puta uključen i Geomycin® te je započeto s „dvojnom terapijom“ Imizol® + Geomycin® koja, jer je omogućila znatno smanjenje uginuća ovaca od „piroplazmoze“ u benkovačkom kraju ubrzo je postala zlatni standard (osobno priopćenje). Svi relevantni anamnestički i klinički podatci ključni da bi se ovce podvrgle „dvojnoj terapiji“ prikazani su taksonomski (osobno priopćenje):
2. Vektorska bolest – u svih oboljelih životinja redovito su prisutni krpelji.
3. Obolijevaju mlađe odrasle jedinke – najčešće u dobi od 5-6 mjeseci do 2 godine starosti. (Do sada nisu zabilježeni slučajevi pobola jedinki mlađih od 5 mjeseci, a starije životinje rijetko obolijevaju.)
4. Obolijevaju introducirane pasmine – križanci introduciranih pasmina s dalmatinskom pramenkom osjetljivije su od „čiste“ pramenke uzgojene na području Benkovca.
5. Bolest počinje gubitkom apetita i zaostajanjem za stadom – vlasnici u anamnezi navode da bolesne životinje prilikom odlaska na ispašu hodaju zadnje za stadom, ne pasu i ne konzumiraju drugu hranu.
6. Bolest muških jedinki – češće obolijevaju muške životinje od ženskih (omjer 1:5) iako je uvriježeno da je populacija muških životinja u stadima puno manja od ženskih.
Tradicionalno se drži jedan ovan na 20-25 ovaca, a sva janjad muškog spola koja se ne ostavlja za rasplod, odstrani se iz stada u starosti od 4-5 mjeseci.
7. Skrotalni edem – vlasnici prvo primijete da se testisi ovnova vidljivo nalaze u nižem položaju od uobičajenog – udaljeniji su od tijela.
8. Febrilna bolest s ubrzanim disanjem – hipertermija; tjelesna temperatura je obično viša od 41 °C, ponekad čak 42 °C popraćena tahipnejom, tahikardijom, smanjenjem broja ruminacija ili potpunim prestankom ruminacija.
9. Anemija sluznica – sluznice prirodnih otvora glave te spolnog i probavnog sustava kao i dijelovi kože koji nisu prekriveni runom ili gustom dlakom poprimaju bijelu boju 4. ili 5. dana od pojave prvih simptoma bolesti.
10. Vodenasta krv koja se sporije gruša – prilikom intramuskularnog apliciranja lijekova oboljelim ovcama u kasnijim fazama bolesti iz mjesta uboda curi krv koja je rjeđa, vodenasta i svjetlije crvene boje.
U odnosu na krvarenja izazvana intramuskularnim aplikacijama lijekova ovcama koje nemaju simptome febrilne anemije krvarenje je puno obilnije i duže traje.
11. Opća hipoksija i letargija – svakim danom trajanja bolesti životinja sve teže hoda, usporena je i vlasnici ju lakše hvataju u stadu među drugim životinjama. Obično 5. do 6. dana od zamjećivanja simptoma, ako se ne pristupi liječenju, životinje legnu i više se ne ustaju).
Ovim radom proširujemo listu anaplazmi utvrđenih na teritoriju Republike Hrvatske te raspravljamo osobitosti i izazovima u dijagnostici i terapiji biološkim vektorima prenosivih febrilnih anemija u ovaca.
Materijali i metode
Opis slučaja
Bolesna životinja
U svibnju 2015. godine na području grada Benkovca u stado ovaca uveden je ovan križanac u tipu dalmatinske pramenke star 2 godine.
Nakon 14 dana vlasnik je primijetio da je ovan apatičan i da prilikom izgona na pašu zaostaje za stadom. Drugog dana nakon pojave simptoma životinja je sve teže hodala, usporeno slijedila stado, a na pašnjaku nije pasla.
Trećeg dana dežurni veterinar Veterinarske ambulante Benkovac je potvrdio apatiju, oslabljenu motoriku i fizičku slabost uz nalaz hipertermije (temperatura 41,5 °C rektalno), tahipneju s izrazito plitkim disanjem (45 udisaja u minuti), tahikardiju (110 otkucaja u minuti), atoniju buraga (auskultacijom buraga nisu utvrđene ruminacije).
Sluznice kapaka bile su bijele boje (anemične), a po koži su uočeni krpelji.
Liječenje
Postavljena je radna dijagnoza piroplazmoze ovaca te je odmah započeta terapija Imizolom® 0,5 mL s/c (Intervet International BV, Podružnica u RH, Imidokarb®, 85 mg/mL; doza 1 mL na 100 kg) kao i potporna terapija vitaminima AD3E i B-kompleksom.
Zahvaljujući empirijskim spoznajama o uspješnosti liječenja febrilnih i anemičnih stanja u ovaca benkovačkog područja koje po koži imaju brojne krpelje, paralelno je administriran i antibiotik oksitetraciklin 5 mL i/m (GENERA d.d., djelatna tvar: oksitetraciklin u obliku oksitetraciklin dihidrata, Geomicin® retard 200 mg/mL; 1 mL na 10 kg; 20 mg OTC/kg).
Liječeni ovan je za pet dana prestao pokazivati kliničke znakove bolesti, odnosno u potpunosti je ozdravio.
Dijagnostika
Neposredno prije aplikacije svih navedenih lijekova, ovnu je prema pravilima struke iz jugularne vene izvađena krv u epruvetu s Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) te je poštom, zaštićena od lomova na sobnoj temperaturi upućena na Hrvatski veterinarski institut u Zagrebu na utvrđivanje uzročnika.
Dokaz uzročnika
Mikroskopska pretraga krvnog razmaza Krvni razmazi pripremljeni su za mikroskopsko pretraživanje prema standardnom protokolu (Benjamin, 2005.). Stakalca su prije fiksiranja apsolutnim metanolom te su obojana komercijalom bojom Diff-Quick® prema uputi proizvođača ostavljena da se na zraku osuše.
Molekularne pretrage krvi
Prisutnost DNK krvnih uzročnika bolesti (Anaplasma spp., Babesia spp., Theileria spp., Mycoplasma spp.) iz krvi pretražene su prema sljedećim protokolima: vrste iz roda Anaplasma odsječkom (345bp) gena (Parola i sur., 2000.). Veći odsječak od 1462 pb kojim je gotovo moguće umnožiti gotovo cijeli 16S rRNK gen (Kawahara i sur., 2006.) korišten je za razlikovanje unutar vrsta anaplizmi pomoću EC9 (5ˊ-TACCTTGTTACGACTT-3ˊ) i EC12 (5ˊ-TGATCCTGGCTCAGAACGAAC-3ˊ).
U drugom koraku, za detaljniju gensku tipizaciju korišten je protokol kojim se umnaža odsječak od 1400 pb 16S rRNK gena anaplazmi te MSP4 (major suface protein 4) početnicama MSP4-F: 5’-GGG AGC TCC TAT GAA TTA CAG AGA ATT GTT TAC-3’; MSP4-R: 5’-CCG GAT CCT TAG CTG AAC AGG AAT CTT GC-3’ (de la Fuente i sur., 2007.).
Prisutnost DNK piroplazmi istražena je umnažanjem odsječkom 18S rRNK gena (600 bp; Beck i sur., 2009.).
Ciljni odsječak 18S rRNK gena duljine 560 pb rodova Babesia i Theileria umnažan je početnicama Bab F (5ˊ-GTCTTGTAATTGGAATGATGG3ˊ) i Bab R (5ˊ- CCAAAGACTTTGATTTCTCTC-3ˊ) (Beck i sur., 2009.).
Za dokazivanje DNK hemotropnih bakterija iz roda Mycoplasma umnažan je ciljni odsječak 16S rRNK gena (Varanat i sur., 2011.) duljine 600 pb. Korištene su prednja početnica Myco 322s (5ˊ-GCCCATATTCCTACGGGAAGCAGCAGT-3ˊ) i stražnja početnica Myco 938as (5ˊ-CTCCACCACTTGTTCAGGTCCCCGTC-3ˊ).
U reakcijama umnažanja korišten je GoTaq®G2 Hot Start Colorless Master Mix (Promega Corporation, Madison, SAD), početnice koncentracije 10 moL/µL te 2 µL izdvojene DNK u ukupnom volumenu od 20 µL. Uspješnost umnažanja provjerena je vizualizacijom putem kapilarne elektroforeze na QIAxcel-u (QIAGEN, Hilden, Njemačka).
U svrhu sekvenciranja umnoženi PCR produkti su pročišćeni pomoću ExoSAP-IT®PCR Clean-Up Reagent (USB Corporation, Cleveland, SAD), prema uputama proizvođača.
Uzorci su sekvencirani u oba smjera u tvrtci Macrogen Europe (Amsterdam, Nizozemska).
Dobivene sekvence su poravnane pomoću računalnog programa Lasergene i potprograma SeqMan i EditSeq (DINASTAR, Madison WI, SAD). Poravnane sekvence su putem tražilice BLAST uspoređene s dostupnim sekvencama u banci gena GenBank® (PubMed).
Rezultati
Mikroskopska pretraga krvnog razmaza
U razmazu krvi obojenom Diff-Quickom® pod povećanjem objektiva x100 uz korištenje imerzionog ulja pronađena su periferno smještena intraeritrocitarna tjelešca (Slika 1).
Molekularne pretrage krvi
Sekvenciranjem kraćeg odsječka od 345 pb 16S rRNK gena i usporedbom s dostupnim sekvencama u bazi gena GenBank nije bilo moguće utvrditi o kojoj se vrsti anaplazme radi, jer su dobivene sekvence u potpunosti bile jednake sa sekvencama više vrsta anaplazmi poput; A. marginale, A. centrale, A. bovis, A. ovis i A. capra.
Sekvencirani duži odsječak od 1400 pb 16S rRNK je bio jednak sekvencama A. ovis (MG869525) i istovremeno se razlikovao od A. marginale u dva bazna para (npr. KU686792).
Anaplasma ovis je u potpunosti potvrđena sekvenciranjem MSP4 gena veličine 800 parova baza. Sekvenca je bila jednaka s 19 sekvenci A. ovis uključujući i referentnu sekvencu pristupnog broja MN198191, dok je istovremeno pokazala i sličnost od svega 91,44 % sa sekvencama A. marginale. Dobivena sekvenca je bila jednaka sekvencama MN094838 iz Tunisa, MK358053 iz Kine, MH790274 iz Irana, LC553532 iz Malawija, MT062868 iz Rusije, MT311200 iz Pakistana, LC141078 iz Mongolije, FJ460454 iz Cipra i KU497700 iz Sudana. U jednom do četiri parova baza razlikovala se od sekvenci A. ovis iz ovaca s Korzike.
Sekvenca MSP4 gena se razlikovala 0,25 % od mađarske sekvence, a od sekevenci A. ovis iz Korzike 0,19 %, 0,38 % i 0,76 %.
Vrste iz rodova Mycoplasma, Babesia i Theileria nisu dokazane lančanom reakcijom polimerazom u uzorku krvi benkovačkog ovna.
Rasprava
Na području Veterinarske ambulante Benkovac godišnje se izliječi i do 150 krpeljima infestiranih ovaca sa simptomima febrilne anemije.
Oboljele jedinke čine oko 0,5 % populacije ovaca s područja djelovanja navedene veterinarske ustanove (osobno priopćenje). Mikroskopski i molekularni laboratorijski nalazi iz krvi oboljelog ovna omogućili su prvi put objektivno razlikovanje anaplazmoze od piroplazmoze ovaca, čime je objektivno potvrđena opravdanost empirijski usvojene „dvojne terapije“ u slučajevima krpeljima prenosivih infekcioznih anemija ovaca u ovomdijelu Republike Hrvatske. Ovaj nalaz predstavlja primjer sinergije terenskih zapažanja, empirijske primjene terapije te modernih dijagnostičkih pretraga u svrhu unaprjeđenja veterinarskih usluga u ovčarstvu.
Prijenosom dugogodišnjeg radnog iskustva s generacije na generaciju, na tradicionalno ovčarskom „terenu“, veterinari Veterinarske ambulante Benkovac ustrajali su u nastojanju da se izbjegne letalni ishod u oboljelih ovaca.
Upravo to podrazumijeva brzu primjenu „dvojne terapije“ koja se provodi pri samom začetku pojave znakova bolesti.
Prema njihovom iskustvu, ako se „reagira“ izvan „urgentnog vremenskog okvira“, u febrilnih i anemičnih ovaca, javit će se letargija. Od trenutka pojave prvih znakova letargije do uginuća obično prođe 24 do 48 sati; letargične ovce koje leže i ne reagiraju na liječenje.
Dakle, vremenski terapijski okvir je uzak, proteže se na minimalno 48 do maksimalno 72 sata od početka pojave znakova bolesti (vlastita opažanja).
Ograničeno vrijeme u kojem se anaplazmoza ovaca može uspješno liječiti kao i činjenica da je razlikovanje anaplazmoze i babezioze u terenskim uvjetima vrlo teško, ponukali su nas da široj veterinarskoj zajednici u Hrvatskoj približimo empirijski postavljen protokol liječenja febrilnih anemija u krpeljima invadiranih ovaca:
2. rani početak terapije uvjetuje vrlo visok % izliječenih životinja (preko 90 %);
3. etiološka/simptomatska uz potpornu terapiju u obliku vitamina (AD3E i B-kompleksom) omogućavaju potpuni oporavak;
4. u oporavljenih ovaca ne dolazi do recidiva bolesti;
5. odgoda terapije uvjetuje porast letalnih ishoda;
6. ako se s liječenjem započne nakon trećeg dana, postotak uspješno izliječenih ovaca opada;
7. izostanak terapije povezan je sa 100 %-tnim uginućem svih oboljelih jedinki koje pokazuju znakove febrilne anemije;
8. životinje koje se ne liječe obično ugibaju petog do sedmog dana nakon prvih znakova bolesti (vlastita opažanja).
U Republici Hrvatskoj do sada je dokazano pet vrsta anaplazmi; A. phagocytophilum, A. platys, A. bovis, A. marginale i A. centrale (Beck i sur., 2014., Huber i sur., 2017., Jurković i sur., 2020.).
Šesta na listi dokazanih vrsta unutar roda Anaplasma u našoj zemlji je i A. ovis, potvrđena je mikroskopskim nalazom morula u eritrocitima i sekvenciranjem 16S rRNK i MSP4 gena u uzorku krvi oboljelog ovna s područja Grada Benkovca. Naš nalaz predstavlja prvi dokaz prisustva ovčje anaplazmoze u Jugoistočnoj Europi čime je potvrđena premisa Renmakera i sur. (2013.) da je rasprostranjenost A. ovis znatno veća od ranijih znanstveno utemeljenih pretpostavki.
U prikazanom je slučaju oboljeli ovan razvio težak oblik anaplazmoze sa svim kliničkim znacima bolesti opisanim u literaturi, a posljedica su „nestanka“ eritrocita iz cirkulacije popraćenih općim infekcionim sindromom (Yasini i sur., 2012.). Anaplazmoza odraslih ovaca je najčešće prisutna u formi inaparentne infekcije u endemskim područjima, dok su teški, akutni oblici bolesti povezani sa stresnim čimbenicima poput onih kojima su ovce sezonalno izložene. Renneker i sur. (2013.) ističu istovremene infekcije različitim uzročnicima bolesti: vrućinu, cijepljenje, partus i slične druge čimbenike kao glavne „okidače“ umnažanja anaplazmi u eritrocitima ovaca. Mikroskopskim i molekularnim pretragama u ovom su slučaju isključene istovremene invazije piroplazmama kao i infekcija hemotropnim mikoplazmama, stoga pretpostavljamo da je stres prouzročen početkom sezone parenja bio pokretač kliničkih znakova bolesti (Yasini i sur., 2012.). Temeljni simptomi anaplazmoze su bljedilo sluznica i tkiva te opća slabost zbog anemije (Alessandra i Sato, 2012., Renneker i sur., 2013., Jimenez i sur., 2019.). Iako je žutica klinički znak povezan s teškim hemolizama, anaplazmoza odraslih ovaca za razliku od drugih krpeljima prenosivih anemija rijetko dovodi do razvoja žutice i/ili hemoglobinurije (Hornok i sur., 2007.).
Objašnjenje ovog fenomena temelji se na izostanku intravaskularnog raspadanja zaraženih eritrocita, koji se isključivo uklanjaju u makrofagima slezene pa razina ekstravaskularne hemolize (Allen i sur., 1981.) mora biti izrazito visoka da bi razgradni produkti hemoglobina prebojili sluznice i tkiva žutom bojom kao što je nedavno opisano u janjadi (Lacastra i sur., 2020.). Usprkos činjenici da je ovaj slučaj iz 2015. godine tek prvi objektivan dokaz A. ovis u populaciji ovaca na području Benkovca, vjerujemo da je mikrorganizam bio i ranije prisutan temeljem terenskog iskustva benkovačkih veterinara, koji ističu da je imidokarb-dipropionat nedostatan u liječenju febrilnih anemija i žutica krpeljima invadiranih ovaca na njihovom terenu od druge polovice 90-tih godina prošlog stoljeća. Nadalje, obolijevaju mlađe životinje koje su prvi puta izložene vektorima i ne javlja se u životinja mlađih od pet mjeseci. Izvorne pasmine ovaca rijetko pokazuju znakove bolesti, odnosno dobro podnose infekciju, a obolijevaju unesene ovce koje ranije nisu bile izložene ili nakon prvog janjenja. Sve navedene činjenice proizašle su iz iskustva terenskog rada te ukazuju na 20-godišnju prisutnost A. ovis na području Grada Benkovca.
Unatoč činjenici da se anaplazmoza ovaca smatra tropskom ili suptropskom bolesti, uzročnik je dokazano prisutan i u susjednoj Mađarskoj te Slovačkoj koje pripadaju središnjoj Europi i predstavljaju enzootska područja A. ovis (Hornok i sur., 2007., Derdakova i sur., 2011.). Promjene okoliša uključujući i klimatske promjene, poput povišenja prosječne temperature okoliša najvjerojatnije pospješuju širenje uzročnika (Lacasta i sur., 2021.). U Republici Hrvatskoj sve je više dokaza da su „tropske anaplazmoze“ prisutne od ranije što potvrđuju nalazi vrsta A. marginale, u goveda s područja Gline, A. bovis i Theileria orientalis u goveda iz Fužina (Jurković i sur., 2020.) te A. platys u pasa sa svih područja kontinentalne Hrvatske i priobalja (Huber i sur., 2017.).
Za očekivati je nove slučajeve do sada dokazanih „tropskih uročnika bolesti“ diljem Hrvatske kao i dokazivanje već prisutnih na području Europe, tj. susjednih država.
Ripicephalus bursa, vektor A. ovis, prisutan na području srednje Dalmacije i zaleđa (Krčmar i sur., 2012.) parazitirao je i na oboljelom ovnu. Krpelj R. bursa je prilagođen mediteranskom području (Estrada-Pena i sur., 2017.) i može imati važnu ulogu prijenosu A. ovis (Cabezas-Cruz et al., 2019.), bez obzira na dokaz DNK ove anaplazme i u drugih vrsta krpelja te u krpuši M. ovinus (Hornok i sur., 2011.). Nadalje, klinički znaci bolesti u opisanom slučaju razvili su se upravo u svibnju kada su krpelji aktivniji što je u korelaciji sa sezonskom pojavnosti bolesti benkovačkih ovaca od svibnja do srpnja kako ju opisuju veterinari. Bez obzira što je opisan jedan slučaj za pretpostaviti je da anaplazma A. ovis enzootska na području Benkovca, nopotrebn a su dodatna istraživanja kako bi mogli dokazati stvarnu proširenost.
Stoga je opravdanost terapijske dijagnoze infekcioznih febrilnih anemija ovaca kombinacijom imidikarbdipropionata i tetraciklina vrlo vrijedna empirijska tekovina terenskog rada veterinara na području Benkovca. Ekonomsko značenje infekcija anaplazmom A. ovis može biti važan čimbenik u zemljama u kojima se stočni fond uglavnom sastoji od ovaca i koza (Rymaszewska i Grenda, 2008., Torina i sur., 2010., Yasini i sur., 2012.). Međutim, subklinička infekcija i prirodna otpornost koju su stekle autohtone pasmine ovaca u enzootskim područjima mogli bi otežati procjenu stvarnog ekonomskog učinka infekcije s A. ovis (Ciani i sur., 2013.). Tek je potrebno istražiti ekonomsko značenje A. ovis u uzgojima malih preživača u Republici Hrvatskoj.
Dijagnostika A. ovis uglavnom se temeljila na mikroskopskom pregledu obojenih krvnih razmaza Giemsom (Shabana i sur., 2018.) no zbog sporog umnažanja anaplazmi u subakutnim i niske bakterijemije u kroničnim infekcijama ne predstavlja pouzdanu metodu. U prikazanom slučaju nakon pregledavanja razmaza i nalaza intracelularnih uklopina smještenih periferno na rubu eritrocita infekcija s A. ovis potvrđena je lančanom reakcijom polimerazom i sekvenciranjem, metodom izbora za dijagnostiku anaplazmoza općenito. Nakon inicijalnog umnažanja i sekvenciranja kraćeg odsječka od 345 parova baza 16S rRNK gena i usporedbe u bazi gena GenBank nije bilo moguće razlučiti o kojoj se vrsti radi, jer je sekvenca bila u potpunosti jednaka sekvencama A. marginale, A. centrale, A. ovis i A. capra. Tek je usporedbom sekvence od 1400 pb 16S rRNK gena i MSP4 gena bilo moguće potvrditi vrstu A. ovis, odnosno razlikovati je od filogenetski srodne A. marginale.
Značenje MSP4 gena u genskoj tipizaciji anaplazmi preživača je neupitan, jer je gen dovoljno sačuvan dok istovremeno posjeduje dovoljan broj varijabilnih nukleotida koje omogućavaju ne samo razlikovanje vrsta već i genskih varijanti, odnosno genotipova, što je potvrđeno istraživanjem na Korzici (Cabezas-Cruz i sur., 2019.). Novo dokazani hrvatski genotip A. ovis se razlikovao u jednom ili dva nukleotida od genotipova s Korzike i iz Mađarske. Za naglasiti je da se dominantan genotip COR1, dokazan u 94,6 % ovaca s Korzike, od ukupno šest različitih genotipova (COR1-COR6) razlikovao u svega jednom nukleotidu od hrvatskog izolata što ukazuje na njihovu srodnost.
Zaključak
Po prvi puta smo molekularnim i mikroskopskim metodama dokazali A. ovis, jednog od mogućih uzročnika biološkim vektorima prenosive infekciozne hemolitičke anemije malih preživača u Republici Hrvatskoj. Nalaz jasno ukazuje da je potrebno uključiti i ovu anaplazmu u dijagnostičke postupke prilikom pojave: anemije, ikterusa, slabosti i povišene temperature u stadima ovaca. Za naglasiti je opravdanost liječenja tetraciklinima temeljenu na praktičnom iskustvu veterinara uz istovremenu aplikaciju imidokarb dipoprionata.
Potrebno je provesti dodatna istraživanja s ciljem razumijevanja značaja infekcija A. ovis u Hrvatskoj, njezine proširenosti i ekonomskog značenja. Nalaz krpelja R. bursa na oboljelom ovnu potvrđuju vektorsku ulogu ove vrste krpelja, no za bolje razumijevanje epizootiologije ove bolesti potrebno je provesti i istraživanje o prisutnosti DNK A. ovis u krpelja prisutnih u okolišu.
Literatura [… prikaži]
The first description of ram infection with rickettsiae Anaplasma ovis in the Republic of Croatia
Tomislav ŠARIĆ, DVM, PhD, Associate Professor, Department of Ecology, Agronomy and Aquaculture, University of Zadar, Zadar, Croatia; Ana BECK, DVM, PhD, Associate Professor, unemployed, Croatia; Ivo TARAŠ, DVM, Ante ŠUTO, DVM, Denis ORLOVIĆ, DVM, Veterinary Practice Benkovac d.o.o., Benkovac, Croatia; Daria JURKOVIĆ, DVM, Expert Associate, Relja BECK, DVM, PhD, Senior Scientific Associate, Croatian Veterinary Institute, Zagreb, Croatia
In late May 2015, a sample of ram blood with suspected piroplasmosis from the vicinity of Benkovac was delivered to the Laboratory for Parasitology of the Croatian Veterinary Institute in Zagreb, Croatia. Therapy with Imidocarb (Imizol® 0.5 mL s/c) and oxytetracycline (Geomycin® retard 5 mL i/m) was started immediately, with supportive therapy with vitamins AD3E and B-complex. The health status improved and clinical signs disappeared after five days, and the ram fully recovered. Peripherally located intraerythrocyte bodies were found in the blood smear, and Anaplasma ovis was confirmed by sequencing the 16S rRNA and MSP4 gene, while the DNA of other pathogens was not present. This research proved the presence of A. ovis in Croatia and in Southeast Europe for the first time. Of the eight species of Anaplasma recognized today, small ruminant anaplasmosis is caused by three species, A. phagocytophilum, A. capra and A. ovis, and to date only A. phagocytophilum has been proven in Croatia. According to veterinarians from the Benkovac Veterinary practice, the described clinical signs of the disease are common in sheep and rams introduced from non-endemic areas and have never been observed in animals younger than five months. It should be emphasized that in addition to Imisol, veterinarians in the Benkovac area always treat sick sheep with tetracyclines, the drug of choice for Anaplasma treatment, and sick animals are successfully cured if treatment is administered within five days of the onset of clinical signs. The vector is the tick Rhipicephalus bursa, which is present throughout the Republic of Croatia and was also found on the infected ram, so it is to be expected that the causative agent is also present elsewhere in Croatia.
Key words: Anaplasma ovis; ram; clinical signs, molecular detection; Benkovac
