Nalaz citrinina u kukuruzu s hrvatskih obiteljskih gospodarstava tijekom petogodišnjeg razdoblja
J. Pleadin, N. Kudumija, T. Lešić, J. Frece, I. Kmetič, L. Dergestin Bačun i K. Markov*
Sažetak
Mikotoksini učestalo kontaminiraju i hranu ljudi i hranu za životinje, ponajprije žitarice i proizvode na bazi žitarica. Citrinin je mikotoksin kojeg sintetiziraju pojedine plijesni iz roda Penicillium, Aspergillus i Monascus, među kojima ga najviše sintetizira P. citrinum. S obzirom na nedostatnost podataka o razinama citrinina u žitaricama, u okviru ovog istraživanja analizirane se njegove koncentracije u kukuruzu (n=158) s obiteljskih poljoprivrednih gospodarstava u Hrvatskoj tijekom petogodišnjeg razdoblja (2017.-2021.). Tijekom petogodišnjeg razdoblja citrinin je detektiran u 25,3 % uzoraka kukuruza prikupljenih na području cijele Hrvatske. Najveća prosječna koncentracija utvrđena je 2016. godine (162,9±162,0 µg/kg) te 2020. godine (154,9±358,8 µg/kg), a najveća koncentracija od 968,6 µg/kg određena je u 2020. godini u uzorku kukuruza uzorkovanom na području južne regije Hrvatske. S obzirom na utvrđenu značajniju kontaminaciju pojedinih uzoraka, može se zaključiti o nužnosti sustavnog nadzora citrinina u hrani za ljude i u hrani za životinje, kao i definiranju najvećih dopuštenih količina ovog mikotoksina u okviru zakonodavstva.
Ključne riječi: citrinin, kontaminacija žitarica, kukuruz, najveća dopuštena količina, zakonodavstvo
Uvod
Mikotoksini su tvari koje predstavljaju sekundarne metabolite plijesni, a učestalo kontaminiraju hranu ljudi i hranu za životinje u ovisnosti o klimatskim i brojnim drugim čimbenicima utjecaja (Pleadin i sur., 2020.). Citrinin je mikotoksin kojeg sintetizira nekoliko vrsta plijesni iz rodova Penicillium, Aspergillus i Monascus. Najviše ga sintetizira P. citrinum koja je široko rasprostranjena plijesan i može se izolirati iz bilo koje pljesnive hrane za ljude i hrane za životinje (Bennett i Klich, 2003., Houbraken i sur., 2011., Doughari, 2015.). P. citrinum raste na temperaturi od 5-40 °C, s optimalnim rastom na 26-30 °C i aktivitetom vode (aw) manjim od 0,80 (Pitt i Hocking, 2009.); osjetljiv je na toplinu i tijekom toplinske obrade se razlaže (Ostry i sur., 2013.).
Toksičnost citrinina u ljudi i životinja još uvijek nije detaljno ispitana (EFSA, 2012.). No poznato je da je kao i okratoksin A nefrotoksičan te se pretpostavlja da je uključen u razvoj balkanske endemske nefropatije (BEN) koju karakteriziraju bubrežna tubularna degeneracija, intersticijska fibroza, anemija, gubitak težine i poliurija. Osim nefrotoksičnosti, istraživanja su ukazala i na potencijalne hepatotoksične, teratogene, fetotoksične i genotoksične učinke citrinina (Liu i sur., 2003., Amalaradjou i Venkitanarayanan, 2008., Flajs i Peraica, 2009. Qingqing i sur., 2010.). Utvrđeno je i da citrinin povećava toksičnost okratoksina A, kako aditivno tako i sinergistički (Ji i sur., 2015.). Zbog nedostatka relevantnih istraživanja o njegovoj kancerogenosti, Međunarodna agencija za istraživanje raka (IARC) svrstala je citrinin u treću skupinu karcinogenih spojeva (IARC, 1986.), što upućuje na nužnost provedbe daljnjih toksikoloških studija.
Pojavnost citrinina dokazana je u različitim žitaricama i proizvodima na bazi žitarica, ali i u grahu, voću, sokovima od voća i povrća, bilju i začinima, maslinama i pljesnivom siru te nekim drugim namirnicama, podrijetlom iz različitih zemalja svijeta (Xu i sur., 2006., EFSA, 2012., Markov i sur., 2013., Ji i sur., 2015., Pleadin i sur., 2018., Oztas i sur., 2020.). Ujedno, literaturni podatci ukazuju na moguću supojavnost okratoksina A i citrinina u hrani za ljude i za životinje (Vrabcheva i sur., 2000., Speijers i Speijers, 2004., Pleadin i sur., 2015., Pleadin i sur., 2018.). Pleadin i sur. (2018.) su u ranijem istraživanju u Hrvatskoj odredili značajne razine u pojedinim uzorcima neprocesiranih žitarica te oko 15 puta veće koncentracije citrinina u odnosu na koncentracije okratoksina A.
Panel Europske agencije za sigurnost hrane (EFSA, engl. European Food Safety Authority) o kontaminatima u prehrambenom lancu (CONTAM, engl.
The EFSA Panel on Contaminants in the Food Chain) je 2012. godine zaključio o mogućem riziku za zdravlje ljudi i životinja povezan s prisutnošću citrinina u hrani za ljude i za životinje (EFSA, 2012.). Utvrđena je nužnost prikupljanja daljnjih podataka o pojavnosti citrinina u hrani u Europi da bi se mogla provesti utemeljena procjena rizika. Stoga je 2015. godine od strane EFSA objavljen poziv za podnošenje prijedloga o istraživanjima citrinina u žitaricama i proizvodima na bazi žitarica iz različitih zemljopisnih regija u Europi. Važno je istaknuti da u Europskoj uniji još uvijek nije propisana najveća dopuštena (NDK) ili najveća preporučena količina citrinina u hrani za ljude i za životinje.
Slijedom potrebe za daljnjim praćenjem pojavnosti citrinina, cilj ovog istraživanja bio je ispitati njegovu pojavnost u kukuruzu s obiteljskih gospodarstava u Hrvatskoj tijekom petogodišnjeg razdoblja te usporediti dobivene vrijednosti s ranije dobivenim podatcima o količinama citrinina u ovoj i ostalim vrstama žitarica podrijetlom iz Hrvatske, kao i drugih europskih zemalja.
Materijali i metode
Uzorkovanje i priprema uzoraka
Uzorci kukuruza uzorkovani su s obiteljskih poljoprivrednih gospodarstava iz pet regija Hrvatske tijekom razdoblja 2017.-2021. godine.
Uzorkovanjem po regijama Hrvatske obuhvaćene su sljedeće županije: sjeverna regija (Međimurska, Varaždinska, Koprivničko-križevačka i Krapinsko- zagorska), središnja regija (Zagrebačka, Sisačko-moslavačka, Karlovačka i Bjelovarsko-bilogorska), zapadna regija (Istarska i Primorsko-goranska), istočna regija (Virovitičko-podravska, Požeško- slavonska, Osječka, Brodsko-posavska i Vukovarsko-srijemska) i južna regija (Zadarska, Splitsko-dalmatinska i Dubrovačko-neretvanska).
Kukuruz je u domaćinstvima bio uskladišten u vrećama, uglavnom na tavanskim i podrumskim prostorijama. Uzorkovanje je provedeno 4-6 mjeseci nakon pohrane uzoraka (razdoblje od veljače do travnja tijekom svake kalendarske godine), a svaki uzorak uzet je u količini od 1,5-2 kg.
Uzorci kukuruza su nakon uzorkovanja unutar 48 sati transportirani u laboratorij. Po 500 g svakog uzorka pomoću analitičkog mlina Cylotec 1093 (Tecator, Švedska) samljeveno je u fini prah veličine čestica od 1,0 mm te su pohranjeni na 4 °C do provedbe analiza.
Kemikalije i uređaji
Ridascreen FAST Citrinin ELISA kit (art. Br. R6302), korišten za provedbu ELISA metoda, nabavljen je od R-Biopharm (Darmstadt, Njemačka). Pakiranje sadrži mikrotitracijsku ploču sa 48 jažica, pet standardnih otopina citrinina (0, 15, 45, 135 i 405 µg/L), konjugat (peroksidom), antitijelo, otopinu supstrata/kromogena (tetrametilbenzidin) i stop otopinu (1N sumporna kiselina). Sve ostale kemiklije korištene za pripremu uzoraka bile su analitičke čistoće. ELISA test proveden je pomoću automatiziranog analizatora ChemWell 2910 (Awareness Technology Inc., SAD).
Ekstrakcija i određivanje citrinina
U 5 g homogeniziranog uzorka kukuruza dodano je 12,5 mL 70%-tnog metanola. Ekstrakcija je postignuta snažnim mućkanjem na tresilici tijekom 3 min, nakon čega su ekstrakti filtrirani kroz filter papir (crna vrpca, Whatman).
Filtrat je razrijeđen deioniziranom vodom (1+1) te je 50 µL otopine upotrijebljeno za ELISA test. Kompetitivna ELISA metoda provedena je potpuno u skladu s uputama proizvođača kita. Nakon dodavanja stop otopine, izmjerene su apsorbancije pri 450 nm. Kako bi se odredila koncentracija (μg/kg) citrinina u svakom uzorku, rezultati dobiveni na kalibracijskoj krivulji pomnoženi su s odgovarajućim faktorom razrjeđivanja uzorka. Primjenjena validirana ELISA metoda ima vrijednost limita detekcije (LOD) 2od 15,0 μg/kg. Ranije provedeni validacijski postupci korištene metode rezultirali su s iskorištenjem od 81,3 % i koeficijentom varijacije (CV) od 9,4 % (Pleadin i sur., 2018.).
Rezultati i rasprava
Rezultati pojavnosti citrinina u kukuruzu određeni u okviru ovog istraživanja u svim regijama Hrvatske, po godinama uzorkovanja tijekom petogodišnjeg razdoblja (2017.-2021.), prikazani su u Tabeli 1.
a Srednja se vrijednost odnosi na uzorke u kojima je citrinin detektiran (> 15 µg/kg).
Tijekom petogodišnjeg razdoblja uzorkovanja citrinin je detektiran u 25,3 % uzoraka kukuruza prikupljenih na obiteljskim gospodarstvima na području cijele Hrvatske. Najveća prosječna koncentracija utvrđena je 2016. godine (162,9±162,0 µg/kg) te 2020. godine (154,9±358,8 µg/kg), a najveća koncentracija od 968,6 µg/kg određena je u 2020. godini. S obzirom na dobivene visoke vrijednosti standardnih devijacija, naročito za 2017. i 2021. godinu, može se zaključiti o širokom variranju utvrđenih koncentracija citrinina u kukuruzu, odnosno o njegovoj sporadičnoj pojavnosti u pojedinim uzorcima.
< LOD – manje od limita detekcije analitičke metode (LOD = 15 µg/kg)
Srednja se vrijednost odnosi na uzorke u kojima je citrinin detektiran (> 15 µg/kg)
U tabeli 2. prikazane su količine citrinina u kukuruzu po regijama Hrvatske, sumarno za sve godine uzorkovanja. Rezultati medijana svih koncentracija citrinina za svaku regiju zasebno, po godinama uzorkovanja, prikazani su na slici 1. (a.-d). U zapadnoj regiji citrinin nije detektiran te stoga grafički podatci nisu prikazani.
*Za uzorke u kojima citrinin nije detektiran za izračun i prikaz rezultata uzeta je vrijednosti 0,5 LOD (7,5 µg/kg)
Najveći udio pozitivnih uzoraka određen je u središnjoj Hrvatskoj (33,9 % u regiji i 12,0 % u odnosu na ukupan broj uzoraka). Unatoč niskoj razini pojavnosti citrinina u uzorcima iz južne Hrvatske (5,1 % u odnosu na ukupan broj uzoraka), najveća razina kontaminacije (968,6 µg/kg) određena je u jednom uzorku kukuruza nepoznatog podrijetla. Nadalje, u jednom uzorku iz središnje regije određena je koncentracija citrinina od 405,0 µg/kg, sa 16% pozitivnih uzoraka iz te regije. S područja zapadne Hrvatske citrinin nije detektiran niti u jednom uzorku.
U južnoj i sjevernoj regiji najveći postotak pozitivnih uzoraka određen je 2019. i 2020. godine, s medijanima od 19,27 µg/kg i 17,99 µg/kg u južnoj regiji, odnosno, 10,26 µg/kg i 15,85 µg/kg u sjevernoj regiji. U središnjoj regiji najveći postotak pozitivnih uzoraka određen je 2017. godine s medijanom od 40,71 µg/ kg, dok u istočnoj regiji 2020. godine s medijanom od 14,04 µg/kg. Rezultati ukazuju na široko variranje utvrđenih koncentracija citrinina u kukuruzu, odnosno na njegovu sporadičnu pojavnost u pojedinim uzorcima, što se može vjerojatno dovesti u vezu s klimatskim i ostalim agrotehničkim uvjetima tijekom uzgoja kukuruza, odnosno s neprikladnim uvjetima pohrane ove žitarice tijekom razdoblja čuvanja.
Budući da najveće dopuštene ili preporučene količine citrinina za hranu za ljude i za životinje još uvijek nisu zakonodavstvom propisane, količine dobivene u ovom istraživanju ne mogu se uspoređivati s propisanim te ih uspoređujemo s rezultatima iz ostalih europskih zemalja i rezultatima iz naših ranijih istraživanja. Podatci EFSA iz 2012. godine, koji su uključivali 30 uzoraka žitarica i proizvoda na bazi žitarica, pokazali su da u 23 uzorka citrinin nije detektiran, a u tri uzorka koncentracija citrinina je bila manja od limita detekcije primjenjene analitičke metode (EFSA, 2012.). U četiri uzorka određen je citrinin u koncentracijama od 1,8; 5,2; 13,2 i 13,6 µg/kg. Budući da dobiveni podatci nisu dostatni za utemeljenu procjenu CONTAM je zaključio da se iz dobivenih rezultata ne može provesti procjena unosa citrinina u ljudski organizam.
Na području Europe koncentracije citrinina u žitaricama široko su varirale, a pojedina istraživanja ukazala su i na značajnije razine onečišćenja. Kononenko i Burkin (2008.) su analizom žitarica (n=766) detektirali citrinin u 4,5 % analiziranih uzoraka pšenice te 3,6 % uzoraka ječma, dok je najmanji udio (1,9 %) pozitivnih uzoraka određen za kukuruz. Međutim, utvrđene koncentracije u kukuruzu imale su značajne vrijednosti i kretale su se u rasponu od 218 do 953 µg/kg. Curtui i sur. (1998.) su u 55 uzoraka pšenice i kukuruza u Rumunjskoj detektirali citrinin u jednom uzorku kukuruza u koncentraciji od 580 µg/kg. Svi analizirani uzorci sadržavali su citrinin u koncentracijama od 17 do 405 µg/kg, dok je u 25 % uzoraka njegova koncentracija bila veća od 405 µg/kg. U Bugarskoj su u uzorcima hrane za svinje i piliće, uzorkovanim na farmi na kojoj su prilikom klanja uočeni pokazatelji nefropatije (povećani i blijedo išarani izgled bubrega), određene povećane količine citrinina. U 2006. godini ovaj mikotoksin je detektiran u 92 % uzoraka hrane za životinje s prosječnom koncentracijom od 54,7±27,5 µg/kg te u 2007. godini u 96 % uzoraka i koncentracijom od 120,5±43,3 µg/kg (Stoev i sur., 2010.). Utvrđene razine iz spomenutih istraživanja ukazuju na moguću značajnu kontaminaciju različitih žitarica citrininom, ujedno i kukuruza, koji općenito predstavlja vrlo značajnu žitaricu za prehranu ljudi i hranidbu životinja u Hrvatskoj.
EFSA je 2017. godine objavila podatke europskih istraživanja iz 2015. i 2016. godine (López Sánchez i sur., 2017.), pri čemu je analizirano ukupno 1195 industrijskih žitarica (pšenica, ječam, raž, zob i riža) i uzoraka gotovih proizvoda iz osam zemalja EU (Francuska, Njemačka, Italija, Litva, Nizozemska, Poljska, Španjolska i Švedska). Citrinin je kvantificiran u 6 % industrijskih žitarica i 3 % proizvoda na bazi žitarica. Općenito, razine citrinina u gotovim proizvodima bile su niže od onih u žitaricama, a najveća koncentracija citrinina određena u industrijskim žitaricama iznosila je 155 μg/kg te u uzorcima na bazi žitarica iz maloprodaje 5,7 μg/kg. Međutim, u ovom istraživanju razine citrinina u kukuruzu nisu ispitivane.
U istraživanju Pleadin i sur. (2018.) provedenom tijekom 2014.-2016. na žitaricama u Hrvatskoj citrinin je određen u 49 % uzoraka različitih žitarica, pri čemu je srednja koncentracija tijekom istraživanog trogodišnjeg razdoblja iznosila 66,8±76,0 µg/kg.
Najveća prosječna količina utvrđena je u pšenici (124±24 µg/kg) tijekom 2015. godine, s najvećom vrijednošću od 374 µg/kg, a u kukuruzu je najveća prosječna koncentracija (71,4±58,7 µg/kg) određena 2016. godine, s najvećom vrijednošću od 247 µg/kg. U pozitivnim uzorcima utvrđene su značajno manje koncentracije mikotoksina u kukuruzu i ječmu iz 2014. u odnosu na uzorke iz 2015. i 2016. godine. U usporedbi s rezultatima dobivenim za žitarice uzorkovane iz osam europskih zemalja u razdoblju od rujna 2015. do studenog 2016., koji su rezultirali sa 6 % pozitivnih uzoraka i koncentracijom citrinina u rasponu od 1,1 do 155 µg/kg (López Sánchez i sur., 2017.), razina kontaminacije uočena u kukuruzu iz ovog istraživanja može se smatrati značajno većom i usporedivom s rezultatima pojedinih europskih istraživanja provedenih tijekom ranijeg razdoblja također na kukuruzu.
Zaključak
Pojavnost citrinina dokazana je u ukupno 25,3 % uzoraka kukuruza prikupljenih tijekom petogodišnjeg razdoblja na obiteljskim gospodarstvima s područja cijele Hrvatske. Njegova najveća prosječna koncentracija utvrđena je 2017. i 2021. godine, a najveća pojedinačna vrijednost određena je u 2021. godini u jednom uzorku kukuruza uzorkovanom na području južne regije. Rezultati ukazuju na široko variranje utvrđenih koncentracija citrinina u kukuruzu, odnosno na njegovu sporadičnu pojavnost s visokim koncentracijama u pojedinim uzorcima, što se može dovesti u vezu s klimatskim i ostalim uvjetima tijekom uzgoja kukuruza, odnosno neprikladnim uvjetima njegove pohrane.
Stoga su potrebna daljnja istraživanja pojavnosti citrinina u jasnoj poveznici s uvjetima uzgoja i pohrane žitarica te provedba sustavnog nadzora i što skorije definiranje najvećih dopuštenih količina ovog kontaminanta za hranu za ljude i za životinje.
Literatura [… prikaži]
Finding of citrinin in maize from Croatian family farms over a five-year period
Jelka PLEADIN, BSc Biotehnol., PhD, Scientific advisor in tenure, Full Professor, Nina KUDUMIJA, BSc Food Tehnol., PhD, Expert Advisor, Tina LEŠIĆ, MSc Biotehnol., Senior Expert Associate, Lidija DERGESTIN BAČUN, BSc Food Tehnol., Senior Expert Associate, Croatian Veterinary Institute, Zagreb, Croatia; Jadranka FRECE, BSc Biotechnol., PhD, Full Professor, Ivana KMETIČ, BSc Biotechnol., PhD, Associate Professor, Ksenija MARKOV, BSc Biotechnol., PhD, Full Professor, Faculty of Food Technology and Biotechnology, Zagreb, Croatia
Mycotoxins frequently contaminate food and animal feed, primarily cereals and cereal-based products. Citrinin is a mycotoxin synthesized by several moulds from the genera Penicillium, Aspergillus and Monascus, including P. citrinum as the most significant producer. Given the lack of data on the levels of citrinin in cereals, its concentration in maize (n=158) from family farms in Croatia was analysed over a five-year period (2017-2021). Citrinin was detected in 25.3% of maize samples collected from throughout Croatia during the five-year period. The highest average concentrations were established in 2016 (162.9±162.0 μg/kg) and in 2020 (154.9±358.8 μg/kg), and the maximum concentration of 968.6 μg/kg was determined in 2020 in maize sampled from the southern region. Given the established significant contamination of certain samples, it can be concluded that there is a need for systematic control of citrinin in food and feed, and to stipulate the maximum permitted limits of this mycotoxin in the legislation.
Key words: citrinin; contamination of cereals; maize; maximum limit; legislation
