Ključne riječi: , , ,

Halofilni vibriji u školjkašima kao potencijalno patogeni uzročnici zoonoza u ljudi

N. Džafić*, K. Kvrgić, L. Kozačinski i A. Humski


Mr. sc. Natalija DŽAFIĆ*, dr. med. vet., (dopisni autor, e-mail: dzafic.vzr@veinst.hr), Kristina KVRGIĆ, dipl. san. ing., stručna suradnica, Hrvatski veterinarski institut, Veterinarski zavod Rijeka, Hrvatska; dr. sc. Lidija KOZAČINSKI, dr. med. vet.; redovita profesorica, Veterinarski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Hrvatska; dr. sc. Andrea HUMSKI, dr. med. vet., znanstvena savjetnica, docentica, Hrvatski veterinarski institut, Zagreb, Hrvatska

Sažetak


Uzgoj, izlov i promet školjkašima reguliran je brojnim zakonima kojima je cilj stavljanje na tržište zdrave hrane.
Zakonodavstvo ne predviđa kontrolu Vibrio spp., što može rezultirati stavljanjem na tržište i konzumacijom školjkaša kontaminiranih bakterijama ovog roda te posljedično prouzročiti pojavu bolesti u ljudi. U radu je prikazano značenje najvažnijih potencijalno patogenih halofilnih vibrija poput V. cholerae, V. parahaemolyticus i V. vulnificus u infekciji ljudi. Tijekom zadnjih dvadesetak godina u zemljama mediteranske regije provedena su istraživanja, koja su redom potvrdila prisutnost vibrija u morskoj vodi, školjkašima, sedimentu i u otpadnim vodama. U Hrvatskoj je u rijetkim istraživanjima školjkaša dokazana duž Jadranske obale prisutnost Vibrio spp., uz dominaciju vrste V. parahaemolyticus.
Sve izraženija pojava globalnog zatopljenja podudara se i s neočekivanim pojavama infekcija s Vibrio spp. na sjeveru Europe, ponajprije na području Baltičkog mora. Četiri su važne značajke pripadnika roda Vibrio koje ih čine pogodnima u procjeni klimatskih promjena. To su: osjetljivost na temperaturu (jako dobro rastu pri temperaturama iznad 15 °C), brzo umnažanje, pojava u područjima gdje se nikada nisu javljali (kao što su sjeverna Europa, Aljaska, Čile, sjevero-istočno područje SAD) i mogućnost ulaska u organizam putem hrane i izlaganjem kontaminiranoj vodi. S gledišta sigurnosti hrane i školjkaša kao hrane, globalno zatopljenje i klimatske promjene imaju značajan utjecaj na dinamiku i rasprostranjenost potencijalno patogenih halofilnih vibrija na područja u kojima nisu povijesno dokazani kao uzročnici oboljenja ljudi. Posljednjih su desetljeća razvijane različite metode s ciljem pouzdanije identifikacije Vibrio vrsta. Radilo se na poboljšanju klasičnih mikrobioloških metoda, a većina je istraživanja usmjerena prema razvoju i primjeni molekularnih tehnika.
Istraživanjima kojima su uspoređivani rezultati kulturelnih mikrobioloških metoda i lančane reakcije polimerazom (PCR), dokazana je značajno veća osjetljivost i pouzdanost molekularnih metoda u dokazu uzročnika.

Ključne riječi: dvoljušturni školjkaši, Vibrio spp., potencijalni patogeni, zoonoze

Uvod


Dvoljušturni školjkaši (razred Bivalvia) su od davnih vremena prisutni kao kvalitetna hrana. Postoje mnoge vrste dvoljušturnih školjkaša, a u Republici Hrvatskoj najviše se uzgajaju dagnje (Mytilus galloprovincialis) i kamenice (Ostrea edulis) te se s njima potrošači najviše i susreću.
Školjkaši se hrane filtriranjem morske vode u kojoj žive, a u jednom satu mogu profiltrirati i više od osam litara vode, pri čemu akumuliraju filtrirane čestice u tkivima i međuljušturnoj tekućini (Ribarić i sur., 2012.), ali i različite mikroorganizme i toksine. Neki od tih mikroorganizama služe školjkašima kao hrana (plankton) dok druge, neprobavljene akumuliraju u svojem tijelu. Tek nakon konzumacije sirovih ili toplinski nedovoljno obrađenih školjkaša, akumulirani mikroorganizmi prelaze u aktivni stadij i tada prouzroče bolest ili intoksikaciju koja može ozbiljno ugroziti ljudsko zdravlje, a ponekad mogu prouzročiti i smrt (Čadež i Teskeredžić, 2005.). Prema ranije objavljenim podatcima nakon konzumacije školjkaša koji su sadržavali akumulirane mikroorganizme uzrok bolesti/trovanja ljudi su u 27 % slučajeva bili virusi, u 60 % bakterije a u 3 % paraziti (Mead i sur., 1999.). Trovanje biotoksinima javlja se ubrzo nakon konzumacije, najčešće sa želučano crijevnim i neurološkim znacima, a većina oboljelih opisuje višestruke znakove bolesti (Munday i Reeve, 2013.).

Najveći broj mikroorganizama u more dospijeva nepročišćenim ili djelomično pročišćenim gradskim otpadnim vodama, ali isto tako mikrobiološko onečišćenje može biti prouzročeno ispiranjem tla jakom kišom i vjetrom, kao i balastnim vodama iz brodova, a more mogu onečistiti i kupači (Krstulović i Šolić, 1997.). Za razliku od drugih mikroorganizama, bakterije iz roda Vibrio (V.) prirodno su prisutne u morskoj vodi i njihove koncentracije variraju sezonski. Većina vrsta može živjeti u širokom rasponu saliniteta, a brojnost im se povećava s porastom temperature (Wittman i Flick, 1995.).

Uzgoj, izlov i promet školjkašima reguliran je brojnim zakonima kojima je cilj stavljanje na tržište “sigurne” hrane.
Zakonodavstvo Europske Unije (Uredba (EZ) 853/2004) (Anonymous, 2004.) zahtijeva da školjkaši u trenutku prodaje budu živi ili odgovarajuće prerađeni, besprijekornih senzornih značajki, ne prelaze dopuštene granice biotoksina i da udovoljavaju Uredbi (EZ) 2073/2005 (broj bakterija Escherichia coli) (Anonymous, 2005.). U Republici Hrvatskoj se praćenje kakvoće školjkaša sustavno provodi prema Planu praćenja kakvoće mora i školjkaša na proizvodnim područjima i područjima za ponovno polaganje školjkaša, a temelji se na određivanju prisutnosti bakterije E. coli kao indikatora mikrobiološkog onečišćenja, biotoksina, teških metala i benzo(a)pirena (Anonymous, 2021.).

S obzirom da je u našoj zemlji razvijena djelatnost turizam, školjkaši su traženi specijalitet te je pri plasmanu na tržište važno osigurati zdravstveno ispravne školjkaše. Do 2015. godine, EFSA-ina godišnja izvješća nisu naglašavala Vibrio vrste kao pojedinačne uzročnike oboljenja u ljudi, već su ih svrstavala u kategoriju “ostalih bakterijskih uzročnika”, da bi u izvješću za 2015. godinu bile evidentirane četiri epidemije u Francuskoj s 29 oboljelih osoba (EFSA/ECDC, 2016.).
Europsko zakonodavstvo ne predviđa nadzor nad prisutnošću Vibrio spp., što može rezultirati stavljanjem na tržište i konzumacijom školjkaša kontaminiranih bakterijama ovog roda te posljedično prouzročiti pojavu bolesti u ljudi. U ovom radu prikazana je proširenost i uloga najznačajnijih potencijalno patogenih halofilnih vibrija poput V. cholerae, V. parahaemolyticus i V. vulnificus.

Potencijalno patogeni halofilni vibriji


Porodica Vibrionaceae pripada redu Vibrionales, razredu Gammaproteobacteria. Bakterije porodice Vibrionaceae oblika su ravnih ili svinutih štapića, veličine 0,3-1,3 x 1,4-5,0 µm; pokretljive su i fakultativno anaerobne (Naglić i sur., 2005.). U rod Vibrio svrstane su mnoge vrste Gram-negativnih štapićastih bakterija. Opisano je 27 vrsta, od kojih je 12 važno za humanu medicinu, a kao uzročnicima infekcija u riba opisano je 15 vrsta (Koneman i sur. 2000.). Vrste V. cholerae (non-O1) V. parahemolyticus, V. vulnificus, V. fluvialis, V. furnisii, V. metschnikovii, V. mimicus, V. alginolitycus, V. harveyi (V. carchariae), Grimontia (Vibrio) hollisae i Photobacterium (Vibrio) damselae uzrokuju bolest u akvatičnih životinja i ljudi. Vibrio infekcija prouzročena vrstom V. vulnificus dokazana je zoonoza, a ostale vrste pripadaju visoko rizičnim uzročnicima bolesti riba i ljudi koji su najčešće zaraženi konzumacijom sirove ribe, rakova i školjkaša.
Različite vrsta riba i vodene ptice su rezervoari i vektori ovih bakterija (Austin, 2010.).

Bakterije roda Vibrio prirodni su stanovnici mnogih mora, obala i rijeka, koji se, ovisno o okolišnim uvjetima, mogu dokazati kao slobodno živući organizmi u vodi, pričvršćeni na planktone, u sedimentu i različitim morskim organizmima.
Zajednička karakteristika pripadnika roda je mogućnost preživljavanja u nepovoljnim okolišnim uvjetima u takozvanom “viable but nonculturable state” (VNS) kada ih se ne može dokazati uzgojem na hranjivim podlogama, ali s nastankom povoljnih okolišnih uvjeta može se dokazati njihova prisutnost mikrobiološkim metodama (Huq i sur., 2013.).

Vibrio cholerae

Najznačajnija od svih vrsta je V. cholerae koja je uzročnik kolere. V. cholerae je prema Gramu negativna pokretna bakterija s jednom polarno smještenom flagelom.
Proizvodi enterotoksin (kolera-toksin) odgovoran za razvoj simptoma bolesti.
Na osnovi lipopolisahardnih somatskih O antigena sojevi te bakterije podijeljeni su u serološke skupine (De Magny i sur., 2011.). Poznato je više od 200 različitih O-antigenih tipova, a epidemije kolere prouzroče sojevi V. cholerae serogrupa O1 i O139. Serogrupa O1 pojavljuje se u 2 biotipa: klasični i El Tor, a oba se mogu klasificirati u tri serotipa: Ogawa, Inaba i Hikojima. Uzročnik kolere osjetljiv je na kiselost (pH <6 ga uništava, a dobro podnosi pH >6). Ostali sojevi koji nemaju O1 i O139 antigene (non-O1 i non-O139) ne proizvode kolera toksin, ali se po biokemijskim svojstvima ne razlikuju od uzročnika kolere i uglavnom prouzroče dijarealne bolesti (Rukavina, 2013.).

Do danas je prepoznato sedam svjetskih pandemija kolere; prvih šest prouzročeno je bakterijom serološke grupe O1, dok je sedma pandemija koja je započela 1961., a traje i danas, prouzročena novim biotipom bakterije V. cholerae O1, El Tor. Bolest prouzročena ovim uzročnikom obično nije tako teška kao kod oboljenja prouzročenih klasičnim O1 biotipom (Colwell, 1996.). Epidemija kolere iz 1992. godine prouzročena je serotipom O139 (Häse i Barquera, 2001.).
Patogenost sojeva bakterija V. cholerae O1 i O139 ovisi o kombinaciji čimbenika virulencije koji uključuju enterotoksin (kolera toksin – CT, gen ctxA) te sposobnost vezivanja i kolonizacije stanica tankog crijeva (faktor kolonizacije, tcpA). Postoje i drugi čimbenici povezani s enteropatogenim učinkom poput hemolizina sličnog El Tor-u (hlyA), zatim termostabilni hemolizin enterotoksin (stn/sto), neuraminidaze (nanH), toksin nalik na Shiga toksin (stx) i drugi (Rivera i sur., 2001.).

Planktoni imaju važnu ulogu za preživljavanje bakterije V. cholerae u vodi, pri čemu u vrijeme cvjetanja mora dolazi do značajnog povećanja broja bakterija.

Dokazana je prirodna povezanost bakterije V. cholerae i zooplanktona kopepoda. Opisan je put širenja i razmnožavanja uzročnika u vodenom okolišu, za razliku dotadašnjem mišljenju epidemiologa koji su smatrali da su jedini rezervoar bakterije V. cholerae probavni organi ljudi i da u vanjskom okolišu uzročnik kratko preživljava (Huq i sur., 1983.). U istraživanju pojavnosti zooplanktona i incidencije kolere na dva područja Bangladeša, ustanovljeno je da su dominantne skupine zooplanktona kopepodi, rotiferi i kladocerani povezane s dokazom bakterije V. cholerae i/ili pojavom bolesti (De Magny i sur., 2011.).
Prilikom pričvršćivanja na površinu fitoplanktona i zooplanktona, bakterija V. cholerae stvara biofilm, dok fitoplanktoni izlučuju cijeli niz organskih tvari koje podržavaju rast slobodno živućih bakterija V. cholerae. Pričvršćivanjem na plankton i stvaranjem biofilma olakšava se preživljavanje bakterije u okolišu, povećavajući njezinu toleranciju prema niskom pH i visokoj temperaturi (Suzita i sur., 2009.). U ekosustavu oceana, sposobnost bakterija za razgradnju hitina ima ključno ekološko značenje. V. cholerae ima hitinazu koja mu omogućuje korištenje hitina kao izvor ugljika, a posjeduje i sustav prepoznavanja hitina i sustav kolonizacije crijeva kopepoda.
Poznato je da jedan kopepod može sadržavati 10 4 do 10 6 stanica V. cholerae (Lipp i sur., 2002.). Okoliš je važan čimbenik u epidemiologiji kolere.
Gustoća naseljenosti, loša sanitarna i zdravstvena infrastruktura ozbiljni su nedostatci u kontroli i suzbijanju bolesti.
Promjena temperature površinske vode i kontaminacija okoliša hranjivim tvarima dovodi do proliferacije fitoplanktona i zooplanktona uz posljedično povećanje brojnosti uzročnika kolere (Harris i sur., 2012.). Kopepodi (Crustacean), planktonski morski račići i trzalci (Diptera, Chironomidae), vodeni kukci, prirodni su rezervoari vrste V. cholerae.

Poznato je da mnoge vrste riba mogu biti rezervoari i vektori V. cholerae. Do sada je bakterija V. cholerae izdvojena iz 22 vrste slatkovodnih i 9 vrsta morskih riba, a u nekoliko slučajeva radilo se i o serovaru O1. Opisana je povezanost konzumacije ili rukovanja sirovom ribom u pojavi nekoliko epidemija kolere. Isto tako se može zaključiti da ribe mogu biti nositelji bakterije u nepovoljnim staništima te ih širiti u vodenom svijetu. V. cholerae je izdvojena iz ribljih crijeva, kože, bubrega, jetre i moždanog tkiva. Vodene ptice isto tako, jer se hrane inficiranim ribama, pogoduju širenju bakterije (Halpern i Izhaki, 2017.).

Različite vrste V. cholerae vrlo su proširene u prirodi, u morskoj i slatkoj vodi, obalama mora i koritima rijeka, a vrlo često se dokazuju u različitih vrsta akvatičnih životinja. Njihova prisutnost posebno je dobro dokumentirana u Aziji i Latinskoj Americi i u obalnim vodama Meksičkog zaljeva. Brojnost im se povećava, osobito u školjkašima i uvijek je povezana s visokom temperaturom površinske vode tijekom toplijih mjeseci i sekundarno s proliferacijom fitoplanktona i zooplanktona. Vibriji mogu preživjeti i razmnožavati se u onečišćenim vodama s povećanom koncentracijom soli pri temperaturi od 10 °C do 30 °C (Harris i sur., 2012.).
U izolatima V. cholerae iz endemičnih područja kolere u Bangladešu, ustvrđena je tolerancija na 6 % soli u 85% izolata, u njih 45 % na 3 % soli dok niti jedan izolat nije preživio uzgoj pri koncentraciji od 8 % soli. Isti izolati testirani su na antimikrobnu rezistenciju, pri čemu je ustvrđeno da je većina rezistentna na barem dva uobičajena antimikrobna lijeka: 95,45 % je bilo rezistentnih na ampicilin, 50 % na eritromicin, 66,63 % na nalidiksičnu kiselinu, 27,27 % na cotrimoxazole. Rast svih izolata koji su pokazali antimikrobnu rezistenciju uspješno je inhibirao ekstrakt biljke Terminalia arjuna, što ukazuje na mogućnost primjene biljnog ekstrakta za tretiranje multirezistentnih sojeva (Fakruddin i sur., 2011.).

Vibrio parahaemolyticus

Bakterija V. parahaemolyticus jedan je od glavnih uzročnika otrovanja hranom posebno u zemljama poput Japana, Indonezije, Tajvana i drugih gdje se obilno konzumiraju sirovi morski plodovi. Uzročnik stvara enterotoksin koji prouzroči gubitak tekućine. Već 24 sata poslije konzumacije morskih plodova prisutni su: vodenasti proljev, abdominalni grčevi, glavobolja, povraćanje i blago povišenje temperature (Letchumanan i sur., 2014.).

U jednom od ranijih istraživanja ekologije bakterije V. parahaemolyticus potvrđena je ovisnost incidencije bakterije s temperaturom vode (Kaneko i Colwell, 1973.). Proširenost V. parahaemolyticus u morskoj vodi ovisi o temperaturi pa se rijetko pojavljuje dok temperatura mora ne dosegne 15 °C ili više. Budući da je prevalencija V. parahaemolyticus u školjkašima ovisna o temperaturi, mogućnost dokaza veća je u školjkaša izlovljenih tijekom proljeća i ljeta, nego zimi. Broj bakterija V. parahaemolyticus u školjkašima nakon izlovljavanja obično je manji od 103 cfu/g, no u uvjetima skladištenja pri temperaturama do 26 °C može se naglo umnožiti za 50 do 790 puta od početne vrijednosti tijekom 24 sata (Su i Liu, 2007.). Utvrđeno je da se uzročnik tijekom zimskih mjeseci pri temperaturi <14 °C, iako je prisutan u sedimentu ne može dokazati u vodi. Porastom temperature vode od kasnog proljeća do ranog ljeta, vibriji koji su prezimili u sedimentu oslobađaju se i šire vodom.
Adsorpcija bakterije V. parahaemolyticus na hitin i kopepode, jedan je od najvažnijih čimbenika koji određuju prirodni habitat te bakterije i njenu ekološku nišu (Kaneko i Colwell, 1975.). Ustanovljen je utjecaj saliniteta na adsorpciju na način da povećanje saliniteta s 4,2 ‰ na 10-16 ‰ smanjuje adsorpciju sa 100 % na 70-80 %, a ustvrđen je i utjecaj pH pri čemu je 100 % apsorpcija dokazana pri pH 6, dok povećanjem pH na 9 adsorpcija pada na 60 %. Može se zaključiti da širenje ovog mikroorganizma ovisi o temperaturi, salinitetu, pH i drugim okolišnim čimbenicima. U tropskim i suptropskim područjima koja karakteriziraju visoke temperature tijekom cijele godine, nema većih razlika u brojnosti bakterije V. parahaemolyticus u morskoj vodi, sedimentu i školjkašima u odnosu na promjene temperature morske vode (Yu i sur., 2013.).

Godine 1996. dokazana je pojava pandemijskog klona bakterije V. parahaemolyticus O3:K6 u jugoistočnoj Aziji (Okuda i sur., 1997.), a 1998. godine uzročnik je dokazan i u Južnoj Americi, u Čileu (Gonzales-Escalona i sur., 2005.).
U gradovima Puerto Montt i Antofagasta prouzročio je oboljenje u oko 1500 ljudi.
Epidemija u Antofagasti povezana je s konzumacijom školjkaša i ustvrđena je prisutnost istog uzročnika u izmetu ljudi i školjkaša. Pretpostavljalo se da je pojava patogenog uzročnika povezana s klimatološkim fenomenom El Niño (Córdova i sur., 2002.). Pandemijski soj je ostao prisutan na području Čilea još nekoliko godina, da bi tijekom ljeta 2006. godine opet masovno obolilo stanovništvo u Puerto Monttu, gdje je 50 % obrađenih uzoraka bilo pozitivno na tdh+ gen pandemijskog soja O3:K6 (Fuenzalida i sur., 2007.).

Od 60-tih godina prošlog stoljeća, bakterija V. parahaemolyticus jedan je od najznačajnijih patogena koji se prenose hranom, a pandemijski soj O3:K6 prouzročio je veliku epidemiju u Japanu, u razdoblju od 1997. do 2001. godine. Proučavanjem velikog broja uzoraka morskih plodova ustvrđena je stalna prisutnost pandemijskog soja bakterije uz značajno smanjenje broja oboljelih. Zaključeno je kako je za manji broj oboljelih zaslužno znatno poboljšanje higijenskih postupaka u fazi distribucije do konzumacije morskih plodova. Ustvrđeno je da je i pohrana na temperaturi manjoj od 10 °C uz primjenu mikrobioloških standarda koji propisuju odsutnost V. parahaemolitycus u 25 g kuhanih plodova, odnosno manje od 100 MPN/g morskih plodova namijenjenih za konzumaciju u sirovom obliku, učinkovita (Hara-Kudo i sur., 2012.).

Vibrio vulnificus

Bakterija V. vulnificus je Gram negativan, halofilni štapić, prvi put izdvojen 1964. godine u SAD (Baker-Austin i Oliver, 2018.). U morskoj vodi bakterije Vibrio spp. mogu biti slobodne ili pričvršćene na veće i manje planktone te u sedimentu, pri čemu je ustanovljeno da se na većim planktonima (>200 µm) može naći bakterija V. alginolyticus, dok je na manjim planktonima (0,45-200 µm) prisutna bakterija V. vulnificus (Montanari i sur., 1999.). Prisutnost bakterije V. vulnificus dokazana je u uzorcima većeg i manjeg planktona te u uzorcima morske vode, pri čemu je najveća gustoća ustvrđena na uzorcima manjeg planktona tijekom ljetnih mjeseci (Maugeri i sur., 2006.).

Izolati bakterije V. vulnificus proizvode čitavi niz čimbenika patogenosti, između ostalih to su polisaharidne kapsule, hemolizin, pili tipa IV, različite proteaze (uglavnom serinproteaze), metaloproteaza koju regulira tzv. Quorum sensing, koji je učinkovitiji na 25 °C nego na 37 °C, i za kojeg se pretpostavlja da bi mogao biti odgovoran za rane na koži udova jer imaju nižu temperaturu od ostatka tijela (Austin, 2010., Cvetnić, 2013.). Povećane koncentracije serumskog željeza važan su element u patogenezi V. vulnificus.
Slobodnog željeza u organizmu nema te ga vibriji dobivaju putem siderofora koje se koriste željezom iz transferina ili laktoferina (Cvetnić, 2013.). Bakterija V. vulnificus simultano proizvodi fenolat i hidroksamat siderofore, pri čemu hidroksamat siderofore omogućuju virulentnim sojevima prihvaćanje željeza od visokozasićenog transferina (Linkous i Oliver, 1999.).

Infekcija s V. vulnificus najčešće se pojavljuje kao bakterijska infekcija putem hrane i kao infekcija površinskih rana (Linkous i Oliver, 1999., Baker-Austin i Oliver, 2018.). Infekcija s V. vulnificus biogrupa 1, može prouzročiti septikemiju u imunokompromitiranih ljudi i onih s povećanim razinama serumskog, slobodnog željeza (obično nakon konzumacije sirovih školjkaša).
Osim u vidu primarne septikemije, infekcija može nastati kontaminacijom postojećih rana morskom vodom ili u dodiru s morskim plodovima i ribama.
Sojevi V. vulnificus biogrupa 2 poznati su kao uzročnici bolesti jegulja, rakova i riba uz napomenu da barem neki od sojeva unutar biogrupe 2 mogu biti patogeni za ljude (Linkous i Oliver, 1999., Austin, 2010., Cvetnić, 2013.). Ova je bakterija odgovorna za više od 95 % smrtnih slučajeva povezanih s morskom hranom u SAD-u, a i dalje su nepoznati mnogi aspekti vezani za biologiju, genom, virulenciju i epidemiologiju uzročnika.
Kao poznatu činjenicu autori navode veću učestalost oboljenja u muškaraca (86 %) nego u žena (14 %), a uglavnom se javlja u starijih od 40 godina (Baker-Austin i Oliver, 2018.).

Metode za dokazivanje i identifikaciju potencijano patogenih Vibrio spp.


Postoji niz različitih metoda koje se primjenjuju za dokazivanje prisutnosti potencijalno patogenih Vibrio spp. Važeće izdanje norme HRN EN ISO 21872-1:2017 Mikrobiologija u lancu hrane – Horizontalna metoda za određivanje Vibrio spp. – 1. Dio: Dokazivanje prisutnosti potencijalno enteropatogenih Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae i Vibrio vulnificus, u odnosu na prethodno, uključuje primjenu dvije temperature za inkubaciju bujonskih kultura, čime se poboljšava dokazivanje prisutnosti V. vulnificus (Anonymous, 2017.). Krute hranjive podloge koje se koriste za izolaciju bakterija Vibrio spp. sadrže različite komponente kojima je svrha inhibicija rasta neželjene mikroflore te poticanje rasta ciljnih mikroorganizama (Harwood i sur., 2004., Anonymous, 2017.). Razvojem metoda za dokazivanje prisutnosti potencijalno patogenih Vibrio spp. ustvrđena je važnost tekućeg medija koji se koristi za razrjeđivanje i obogaćivanje uzoraka (Azanza i sur., 1996.). Zahvaljujući rezistenciji bakterije V. parahaemolyticus na polimiksin B, razvijen je slani bujon s polimiksinom B, pH vrijednosti 7,4 koji je omogućio postizanje boljih rezultata kada se koristio kao drugi bujon za obogaćenje, jer je smanjio mogućnost razvoja kompetetivne mikroflore (Blanco-Abad i sur., 2009.). Vodič koji je izdao FAO/WHO (2016.) navodi mogućnost primjene različitih metoda dokazivanja i određivanja broja bakterija u odnosu na krajnji cilj koji se želi postići. Tako se za metode dokazivanja navodi da su primjenjive za monitoring i nadziranje izlovnih područja.

Bonnin-Jusserand i sur. (2017.) potvrdili su manjkavost klasičnih mikrobioloških metoda u smislu dugotrajnosti postupaka, manje specifičnosti te ograničenja biokemijske identifikacije, koja često daje krive rezultate zbog velike fenotipske sličnosti različitih Vibrio vrsta. Prema istim autorima preporučljivo je uključiti molekularne metode (PCR, qPCR, LAMP), s ciljem smanjenja pogrešne identifikacije, a navode i nedostatak klasične mikrobiološke metode u smislu nemogućnosti dokazivanja patogenosti dobivenih izolata.

Posljednjih desetljeća istraživane su različite metode s ciljem pouzdanije identifikacije Vibrio vrsta. Neki su autori radili na poboljšanju mikrobioloških metoda (Pendru i sur., 2009.), dok je većina radova temeljena na razvoju i primjeni molekularnih tehnika – konvencionalni PCR (Bilung i sur., 2005.), PCR u stvarnom vremenu – RT PCR (Wang i Levin, 2007.), multiplex PCR (Lee i sur., 2003.). U nekim istraživanjima uspoređivani su rezultati kulturelnih mikrobioloških metoda i PCR-a, gdje je dokazano da su molekularne tehnike znatno osjetljivije i pouzdanije u dokazu uzročnika (Rosec i sur., 2012.).

Vibrio spp. u zemljama Mediterana


Tijekom zadnjih dvadesetak godina provedena su istraživanja u zemljama mediteranske regije koja su potvrdila prisutnost vibrija u morskoj vodi, školjkašima, sedimentu pa i u otpadnim vodama.

U Hrvatskoj je, a dijelom i u Sloveniji, ranijim istraživanjima duž Jadranskog mora (Izola, Poreč, Limski kanal, Rijeka, Krk, Novigrad, Biograd, Murter, Šibenik-Skradin, Pakoštane i Ston) u različitim uzorcima morske hrane dokazana prisutnost Vibrio spp. u 9,3 % od 150 obrađenih uzoraka. Najzastupljenija vrsta bila je V. parahaemolyticus u 6,7 % i V. vulnificus u 2,7 % obrađenih uzoraka.
Pozitivni nalazi bili su utvrđeni na Krku u 20 % uzoraka, Biogradu (14,3 %), Novigradu (8,9 %), Šibeniku-Skradinu (8,3 %), Poreču (5,6 %) i Izoli (4,6 %) (Ivezić-Jakšić, 1986., cit. Mikuš i sur., 2010.). Jakšić i sur. (2002.) navode nalaz V. parahaemolyticus u morskoj hrani na tržnicama i u hotelskoj ponudi. Tako je na tržnicama postotak pozitivnih uzoraka varirao od 4 % do 12 %, s najučestlijim brojem dokaza u školjkašima, dok je u uzorcima morske hrane podrijetlom iz hotela taj postotak bio viši, a kretao se od 10 % do 50 %. Čanak i sur. (2018.) u određivanju mikrobiološke populacije u svježoj ribi (lubin) i školjkašima (dagnje i kamenice) iz južnog Jadrana dokazali su Vibrio spp. u pet (33,3 %) od 15 obrađenih uzoraka. V. cholerae izdvojen je iz uzoraka crijeva i želuca jednog lubina, a iz četiri uzorka škrga, probavne žlijezde i želuca dagnji i kamenica izdvojen je V. parahaemolitycus.

U dagnjama izlovljenima na odobrenim uzgajalištima na talijanskom području Jadranskog mora dokazana je prisutnost bakterija V. algynolitycus u 32,2 % uzoraka, V. vulnificus u 17.7 % uzorka, V. cincinnatiesis u 3,2 % uzoraka te V. parahaemolyticus, V. fluvialis i V. cholerae non O1 u 1,6 % uzoraka (Ripabelli i sur., 1999.). U Jonskom moru (Tarantski zaljev, Mar Piccolo) najčešće je u morskoj vodi i u dagnjama izdvojena vrsta V. alginolyticus (Cavallo i Stabili, 2002.). Ottaviani i sur. (2005.) navode da je na odobrenim uzgajalištama dagnji na području Jadranskog mora (središnja Italija) ustvrđena prisutnost bakterije V. parahaemolyticus. Rezultati trogodišnjeg istraživanja pojavnosti bakterija V. parahaemolyticus, V. vulnificus i mikroorganizama fekalnog podrijetla u dagnjama u maloprodaji u regiji Puglia, Italija, pokazali su da je od 600 pretraženih uzoraka V. parahaemolyticus dokazan u 47 (7,83 %), a V. vulnificus u 17 (2,83 %) uzoraka (Normanno i sur., 2006.).
Istraživanjima dagnji iz Jadranskog mora na jugu Italije, dokazana je vrsta V. parahaemolyticus (Vernocchi i sur., 2007.). U razdoblju od lipnja 2006. godine do lipnja 2007. pretražena su 144 uzorka dagnji iz različitih centara za pročišćavanje na jugu Italije. Od 47 izolata za koje je pretpostavljeno da pripadaju vrsti V. parahaemolyticus, potvrđeno je biokemijskom identifikacijom njih 12 (25,5 %), da bi od toga njih 9 (19,1 %) bilo potvrđeno molekularnim tehnikama.
Među istraživanim izolatima jedan je izdvojen i dokazan tijekom zimskih mjeseci (Di Pinto i sur., 2008.). Školjkaši podrijetlom iz regija Veneto i Sardinija, Italija, pretraživani su od svibnja 2011. do kolovoza 2012. godine, V. parahaemolyticus je dokazan u 56,7 % uzoraka iz Sardinije te u 27,5 % uzoraka iz Veneta (Suffredini i sur., 2014.).

Prvi dokaz prirodno prisutne bakterije V. vulnificus u uzorcima morske vode i školjkašima bio je na području Španjolske u proljeće 1996. (Covadonga i sur., 1998.), dok je prisutnost iste bakterije u kanalizacijskim vodama, školjkašima i morskoj vodi na području Valencije u Španjolskoj dokazana 2009. godine (Canigral i sur., 2009.). Godine 1999. dokazani su slučajevi oboljenja ljudi izravno povezani s konzumacijom školjkaša u Španjolskoj (Galicija). U uzorcima stolice oboljelih ljudi dokazana je prisutnost bakterije V. parahaemolyticus, što je ujedno značilo prvu potvrdu prisutnosti tog patogena u morskom okolišu Europe (Lozano-Leon i sur., 2003.).

Globalno značenje Vibrio spp.


Pojava bolesti prouzročenih vibrijima prije je bila ograničena na tropska i suptropska područja, zemlje u razvoju s netretiranim kanalizacijskim vodama te područja u kojima je tradicionalno uvriježena konzumacija sirovih školjkaša i drugih morskih plodova. Svjedoci smo pojave globalnog zatopljenja o čemu se govori u svim sferama ljudskog postojanja. S gledišta sigurnosti hrane i školjkaša kao hrane, globalno zatopljenje i klimatske promjene imaju značajan utjecaj na dinamiku i rasprostranjenost potencijalno patogenih halofilnih vibrija na područja u kojima nisu povijesno dokazani kao uzročnici bolesti u ljudi.
Korištenjem dugoročnih podataka o površinskoj temperaturi Baltičkog mora, ustvrđeno je dotad nezabilježeno povećanje temperature od 0,063 do 0,078 °C godišnje, što na stoljetnom nivou iznosi 6,3 do 7,8 °C. Navedeno zagrijavanje podudara se s neočekivanim pojavama infekcija s Vibrio spp. na sjeveru Europe, ponajprije na području uz Baltičko more, pri čemu brojevi i distribucija slučajeva korespondiraju s prostornim i vremenskim pikovima površinske temperature mora. To je jedan od prvih dokaza da antropogena promjena klime dovodi od pojave infekcija s Vibrio spp. u umjerenim područjima kroz utjecaj na rezidentne bakterijske zajednice, implicirajući da taj proces utječe na preoblikovanje distribucije zaraznih bolesti na globalnoj razini (Baker-Austin i sur., 2012.). Ustanovljeno je i povećanje učestalosti pojave masovnih uginuća morskih životinja (Le Roux i sur., 2015.).

Do 2015. godine, EFSA-ina godišnja izvješća nisu razlučivala Vibrio vrste kao pojedinačne uzročnike bolesti u ljudi, već su ih svrstavali u kategoriju “ostalih bakterijskih uzročnika”, da bi u izvješću za 2015. godinu evidentirali četiri epidemije u Francuskoj s 29 oboljelih osoba (EFSA/ECDC, 2016.). Na području Švedske i Finske 2014. godine zabilježeno je 89 slučajeva infekcije Vibrio vrstama što je značajno više u odnosu na dotad prijavljene slučajeve u sjevernoj Europi. Pojava infekcije vezana je uz neuobičajeno povišene temperature mora u srpnju i kolovozu, kad je evidentirana temperatura bila nekoliko stupnjeva viša od prethodno najviših temperatura evidentiranih ranih 1980-ih godina (Baker-Austin i sur., 2016.). Četiri su važne značajke pripadnika roda Vibrio koje ih čine pogodnim za korištenje kao “barometar” klimatskih promjena. To su: osjetljivost na temperaturu (svi pripadnici roda jako dobro rastu pri temperaturama iznad 15 °C), brzo umnažanje (u povoljnim uvjetima vrijeme umnažanja je 8 do 9 minuta), pojava u područjima gdje prije nisu bili dokazani (pojava bolesti u područjima koja povijesno nisu povezana s Vibrio infekcijama, kao što su sjeverna Europa, Aljaska, Čile, sjeveroistočno područje SAD). Posebnost vibrija je i u činjenici da imaju više mogućnosti ulazaka u organizam putem hrane, ali i izlaganjem kontaminiranoj vodi (Baker-Austin i sur., 2017.).

Prema Europskoj agenciji za okoliš globalno povišenje površinske temperature mora je jedan od najvažnijih fizikalnih pokazatelja promjene klime.
Povećanje površinske temperature mora na području Europe raste 4-7 puta brže tijekom zadnjih desetljeća u odnosu na svjetske oceane. To povećanje je povezano s pojavom bolesti u ljudi prouzročenih s V. cholerae non-O1 non-O139, V. parahaemolyticus i V. vulnificus.


Literatura [… prikaži]

Halophilic vibrios in shellfish as potentially pathogenic causative agents of zoonoses in humans


Natalija DŽAFIĆ, DVM, MSc, Expert Associate, Kristina KVRGIĆ, BSc. Sanit. Ing., Expert Associate, Croatian Veterinary Institute, Veterinary Department Rijeka, Croatia; Lidija KOZAČINSKI, DVM, PhD, Full Professor, Faculty of Veterinary Medicine University of Zagreb, Croatia; Andrea HUMSKI, DVM, PhD, Scientific Advisor, Assistant Professor, Croatian Veterinary Institute, Zagreb, Croatia

Breeding, collection and trade of bivalve molluscs is regulated by a number of laws aimed at placing healthy food on the market.
The legislation does not provide for the control of Vibrio spp., which may result the marketing and consumption of bivalve molluscs contaminated with Vibrio spp. bacteria, ultimately causing human disease.
The significance of the most important potentially pathogenic halophilic vibrios, such as V. cholerae, V. parahaemolyticus and V. vulnificus, in human infection is presented in this paper. Over the last twenty years, research has been conducted in the countries of the Mediterranean region, confirming the presence of vibrios in seawater, shellfish, sediment and wastewater. In Croatia, the presence of Vibrio spp. has been proven in rare studies along the Adriatic coast, with the dominance of V. parahaemolitycus in shellfish. The increasingly pronounced phenomenon of global warming coincides with the unexpected occurrence of Vibrio spp. infections in northern Europe, primarily in the Baltic Sea. Four important features of the members of the genus Vibrio make them suitable for assessing climate change. These are temperature sensitivity (very good growth at temperatures above 15°C); rapid replication; occurrence in areas where they have never occurred (such as northern Europe, Alaska, Chile, northeast USA), and the possibility of entering the body through food consumption and exposure to contaminated water. From the point of view of food and shellfish safety as food, global warming and climate change have a significant impact on the dynamics and distribution of the potentially pathogenic halophile vibrios in areas where they have not historically been proven to cause human diseases. In recent decades, various methods have been developed with the aim of more reliable identification of Vibrio species. The aim was to improve classical microbiological methods, while numerous studies were based on the development and application of molecular techniques. Studies comparing the results of culture microbiological methods and polymerase chain reaction (PCR) have proven to have significantly higher sensitivity and reliability in the detection of pathogens.

Key words: bivalve molluscs; Vibrio spp.; potential pathogens; zoonoses

Podijeli...

hr Hrvatski
X